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      1. <delect id="0yvdk"><form id="0yvdk"></form></delect>

            细胞培养常见26个问题

            1.如何选用培养基?

            培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,**MEM做粘附细胞培养、RPMI- 1640做悬浮细胞培养,各种目的无血清培养的**是AIM V培养基(SFM)

            2.为什么要热灭活血清?

            加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

            3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

            L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有**终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

            4.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

            GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。

            GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有**小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

            5.为什么培养基中可以省去加酚红?

            酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

            6.如何用台盼兰计数活细胞?

            用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升,在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。

            7.如何消除组织培养的污染?

            重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。shou先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。

            高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。

            下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤:

            1 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

            2 分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

            3 每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

            4 确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。

            5 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

            6 重复步骤4。

            7 在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否以已被消除。

            8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

            丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

            9.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?

            GIBICO的胎牛血清 没有预老化,储存在2-8℃时,血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清,避免反复冻融。

            10.目录上说,Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

            HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在 CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

            11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?

            Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序,而且除了这些标准检测,Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测:

            End-Point Determination of Endotoxin Content
            噬菌体检验
            生物化学检测
            激素的检测
            血红蛋白检测
            Sf9 细胞生长促进及方法学检测

            12.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

            二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。#p#分页标题#e#

            13.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗?

            是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀释试剂在100μl OPTI-MEM中,稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育**少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后,在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前shou先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体,接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。

            14.我使用SF900 Ⅱ时,细胞生长良好,但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?

            如果目的蛋白是一个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的**底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。

            15.如何检测内毒素(热源)水平?

            LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的**敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统),通过修饰凝集素,产生一种透明的胶,LAL中的凝固蛋白,从而,形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。
            胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island,按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前,用无热源的水1:10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟,以消除抑制剂。(通常,血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程,使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)

            16.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗?

            如果使用固体形式的培养基,需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌,应该高压灭菌琼脂溶液,然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

            17.20℃下配制的缓冲液,在较高或较低的温度下PH值会改变吗?
            对于普通使用的缓冲液,PH值随温度变化而变化。
            下表列出温度改变10℃时,PH值的变化情况
            例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.78
            缓冲系统 pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃
            Mes 6.15 -0.110
            Ada 6.60 -0.110
            Pipes 6.80 -0.085
            Aces 6.90 -0.200
            Bes 7.15 -0.160
            Mops 7.20 -0.013
            Tes 7.50 -0.200
            Hepes 7.55 -0.140
            Tricine 8.15 -0.210
            Tris 8.30 -0.310
            Bicine 8.35 -0.180
            Glycylglycine 8.40 -0.280

            18.室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用时PH值是多少?

            缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同的PH值。
            4℃ 25℃ 37℃
            8.1 7.5 7.2
            8.2 7.6 7.3
            8.3 7.7 7.4
            8.4 7.8 7.5
            8.5 7.9 7.6
            8.6 8.0 7.7
            8.7 8.1 7.8
            8.8 8.2 7.9
            8.9 8.3 8.0
            9.0 8.4 8.1
            9.1 8.5 8.2
            9.2 8.6 8.3
            9.3 8.7 8.4
            9.4 8.8 8.5

            19.昆虫细胞培养的**适PH值和渗透压是多少?

            生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系,在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的**适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式,减少技术问题,保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

            20.High Five细胞有任何其它名称吗?

            High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

            21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别?

            PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用,PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基,也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。

            22.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?

            High Five无血清培养基中去污剂的浓度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。

            23.High Five细胞用多大的密度冻存?

            3.0x10E6 cells/ml

            24.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀,加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗?

            可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解,对实验不会有不利的影响。

            25.如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?

            我们强力推荐使用脱落细胞的方法,因为这项技术破坏性**小,生活力**高。正如手册上所显示,通过使用巴氏德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在**必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。#p#分页标题#e#
            胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞:
            1. 去除培养基。
            2. 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS.
            3. 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。
            4. 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
            5. 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)
            6. 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。
            7. 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

            26.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少?

            为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。

            27.如何评估ES细胞合格的胎牛血清?

            使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。
            相关生长效率分析:
            当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中,检测开始和支持ES细胞克隆的能力。
            细胞毒分析:
            当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中,检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。
            相关形态学和分化分析:
            检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红,分化的细胞较大,丰满,颜色较浅。
            所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的,培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。(ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。)
            经过培养发现,大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。

            28.在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗?

            通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候记数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降,它们的感染力将不在是有效的。
             
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