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            细胞培养操作指南

            1,原代细胞培养
            原代培养需要严格要求:(1)取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤,需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶(4)由于原代培养组织细胞的存活率很低,故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。(5)营养丰富的培养基比单一的培养基更可取,如果要添加血清,胎牛血清比牛马的血清更好。(6)对于取材部位易于感染(如皮肤)应先用70%乙醇消毒,在无菌条件下切除组织,尽快转移入BSS或培养基中。不要再培养室取材,因为动物可引入微生物污染。若必须推迟,可保存在4℃,72h。
            1. 剪切组织 
            先将所取得的组织,用D-Hanks或Hanks液清洗,以去除表面血污,并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后,用手术剪将组织剪成若干小块,移入青霉素小瓶或小烧杯中,加入适量缓冲液,用弯头眼科剪,反复剪切组织,直到组织成糊状,约1mm3大小。静置片刻后,用吸管吸去上层液体,加入适当的缓冲液再清洗一次。
            2. 消化分离 
            消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞,以利于进一步的培养,常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
            3. 培养
                细胞悬液用计数板进行细胞计数,用培养液将细胞数调整为2~5×105 cells/m1,或实验所需密度。分装于培养瓶中,使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内,5%CO2,37℃静置培养。一般3~5d,原代培养细胞可以粘附于瓶壁,并伸展开始生长,可补加原培养液量1/2的新培养液,继续培养2~3 d后换液,一般7~14 d可以长满瓶壁,进行传代。 
            注意事项:
              1. 无菌操作 细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因,必须加强各个环节的无菌操作观念,以预防为主,一旦污染,一般是很难消除。 
              2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同,对培养液的要求有一定的差异,必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
              3. 小牛血清 小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后,就保持应用**实验完成。
              4. 胶原酶溶液 必须新鲜配制,贮存时间过长(即使是-20℃低温保存),也将影响消化效力,导致消化时间过长,细胞损伤增加。
              5. L—谷氨酰胺 几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞会因生长不良而死亡。谷氨酸胺在溶液中很不稳定,加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时,就应重新加入原来量的谷氨酰胺。
              6. 静置培养 原代细胞在消化分离后,置于CO2培养箱的头24-48h (必要时72 h)内,应处于**静置状态,切忌不时地取出培养瓶观察生长状况,这将使原代分离细胞难以贴壁,更谈不上伸展和增殖。这对初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成份会消耗光,在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。
              7. 消化时间 一般消化**肉眼尚可见微小组织颗粒即可,因为此时组织颗粒已经松散,略经吹打即成细胞团或单个细胞,过久的消化往往导致细胞损伤加重,细胞培养成活率降低。
              8. 其它生长因子经过以上处理,一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子。如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外,内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用,但费用较高。
                        原代外植(组织块培养)
            简介:组织切碎并清洗,组织块接种于培养瓶或皮氏培养皿的表面,加入少量含高浓度血清(40%-50%)的培养基,表面张力使标本保持原位,直到他们自发地贴附于表面,随后细胞开始生长。此方法适合小量组织培养,如皮肤活检组织,为了尽可能减少细胞损失,而不用酶或机械方法。
            操作流程:切割→细切→沉淀清洗→清洗后用吸管转入培养瓶→倾斜培养瓶吸出平衡盐溶液→然后加入一薄层培养基→培养2-3w,
            无菌材料:培养基(DMEM与F12等体积混合,再加20%胎牛血清);100ml的DBSS;9cm皮氏平皿,非组织培养级别;尖头镊子,尖头手术刀;100ml广口移液器;15或20ml离心管;25平方厘米的培养瓶或5厘米的皮氏培养皿,大约100mg组织用5个25平方厘米的培养瓶。开始每瓶放1ml培养基,随后3-5天每瓶加**5ml.
            操作步骤:
                1,将组织移入新鲜无菌BSS浸洗
                    2,移入第2个培养皿切除多余组织,如脂肪或坏死组织,用手术刀交叉切成约1mm3的小块。
                    3,用移液管(先用BSS浸润,否则组织块易贴壁)将组织块移入15或50ml离心管或普通容器中,让组织块静置沉淀。
                    4,用BSS重悬冲洗组织块后静置,去除上清液,重复两次或更多#p#分页标题#e#
                    5,将20-30个组织块接种在25平方厘米的培养瓶内(记住湿润移液管)
                    6,将培养瓶静置放置一会,待组织块沉下去,然后稍微倾斜吸出液体,然后以每25平方厘米生长面加入1ml的培养基,缓缓倾斜培养瓶让组织块均匀分布于生长面上。
                    7,盖上瓶盖,放到37℃培养箱中18-24h.
                    8, 如果组织块已经贴附,则可在未来3-5天内将培养基加**5ml.先预温,以后每周更换一次,直到细胞已生长
                    9,外植块可以自生长中心用镊子取出,用预先浸洗的移液管移入新的培养器皿中,,然后盖上盖子,再继续培养。
                   10.更换**瓶的培养基直**细胞生长超过生长面积的一半,此时细胞可以传代。
            总结:此种方法贴壁率很低,但是可用通过一些方法进行改进。如在外植物的上方放一块盖玻片,或将外植物置于盖玻片的边缘, 
                       2酶的解离消化
            组织中细胞与细胞之间的粘附是依靠多种相互作用的同类糖蛋白分子,其中部分粘附分子具有钙离子依赖性(钙粘素),故对EDTA较为敏感,螯合素含有钙离子结合结构域,可结合到细胞外机制中的RDG序列。细胞间基质和基底膜中含有其他糖蛋白对蛋白酶较为敏感;选择消化液**容易的方法是从单一的消化液入手,过渡**复合的消化液,开始用胰蛋白酶或胰蛋白酶/EDTA的混合物,后加入其他蛋白酶促进消化。由于新生和成年动物细胞经开始分化,纤维结缔组织及细胞外基质增多,未分化的增殖细胞减少。对组织进行分离时,损害愈严重(长时间的胰酶消化,搅拌),组织越易被破坏成碎片,为了保持**大活性,无论酶的纯度如何,应该**大限度的减少胰蛋白酶对细胞的作用时间。当整块组织在37℃的胰酶中消化时,已分离的细胞应每隔半小时收集一次,胰蛋白酶经离心去除,再以含血清的培养基中和。即可以应用冷消化或温胰酶消化。
            2.1胰酶的温消化
            此技术适应于在相当短的时间消化大的组织尤其是整个小鼠胚胎或鸡胚。由于成年组织有大量纤维结缔组织,故成年组织不用此法。较敏感的细胞如上皮细胞也不用此法。
                无菌材料:组织1-5g,DBSS50ml,用PBSA或正常生理盐水配制的2.5%粗制胰酶;PBSA 200ml,含血清的生长培养基(DMEM/F12加10%胎牛血清);培养瓶,每克组织5-10个(根据培养的细胞不同而改变);9cm皮氏平皿,非组织培养级别;两个50ml离心管;250ml锥形瓶;磁力搅拌子在试管中高压消毒;弯头镊子,2ml,10ml移液管。
            非灭菌材料:磁力搅拌器,细胞计数板
            操作步骤:
               1,将组织块移入加有新配制的无菌DBSS皮氏培养皿中,清洗
               2,转入另一培养皿,切除多余组织如脂肪或坏死组织,用刀切成约3mm3小块
               3,用弯头镊将组织移入15ml或50ml无菌离心管或容器中,让组织块沉淀
               4,用DBSS清洗组织块,组织块沉淀,去除上清液,如此反复2次以上。
               5,将组织块转入一个空的锥形瓶中,去除多余液体,然后加入180ml的PBSA,
               6,加入2.5%的胰酶20ml。以使胰酶**终浓度为0.25%
               7, 在锥形瓶中加入搅拌子
               8,封住锥形瓶,放到搅拌器上,在37摄氏度温箱内搅拌
               9,每分钟100r, 30min
               10,,30min后,收集解离的细胞: 让组织块沉淀; 吸出上清液,置入离心管中,放在冰上,向锥形瓶中加入新的胰酶溶液消化剩余的组织块,继续搅拌并孵育 30min; 收集的细胞悬液以500g,5min离心; 用10ml含血清培养基重悬细胞团,储存于冰浴中。
               11,重复第10步的过程直**消化完全为止(大约3-4h)
               12,  收集冷的细胞悬液,用血球计数板进行细胞技术,并检测细胞活性
               13,将细胞悬液用培养基稀释,使每毫升培养基含有1 x 106个细胞。接种到培养瓶中,大约每平方厘米为2 x 105个细胞。但是对于存活率不明确或难以预知时,细胞计数无价值。此时建议每毫升5-25mg组织的浓度接种。
               14,每隔2-4天更换一次培养基(以PH下降为标准)。由于部分细胞粘附较慢甚**易于悬浮生长,所以更换上清液前要先检查上清液中存活的细胞。
            总结;此方法应该把握时间,减少对细胞的损伤。可以通过如下简单方法来减少细胞的损害:在4℃将组织浸入胰酶,胰酶此时活性很小的条件下浸透组织,然后放在37℃, 在很短时间即可将组织消化。
             2.2胰酶的冷消化
            无菌材料:培养基(DMEM/F12,含10%胎牛血清);DBSS;  0.25%粗制胰酶溶于无血清的RPMI1640或MEM/Stirrer salts(S-MEM)中;9cm皮氏平皿,非组织培养级别;直头,弯头镊子;剪刀;25ml螺口锥形瓶;25cm2、75cm2培养瓶;2ml,10ml移液器
            非灭菌材料:冰浴
            操作步骤:
                 1,将组织移入加有新配制的无菌DBSS的皮氏培养皿中,清洗。
                 2,转入另一培养皿中,切除多余组织如脂肪和坏死组织,用手术刀细切成大约3mm#p#分页标题#e#3的小块,对于胚胎器官若小于3mm3可以全部保留
                 3,用弯镊子将组织块移入15ml或50ml无菌离心管或普通容器中,让组织块沉淀
                4,用BSS重悬冲洗组织块,沉淀后去除上清,重复此步骤2次以上
                5,去除剩余液体,每克组织加入10ml溶于RPMI1640的0.25%胰酶,置于4℃。
                6,在4℃放置6-18h,
                7,小心去除胰酶,余下组织及残余胰酶(若需要此时可以加入1-2ml其他酶)
                8,37℃,放置20-30min
                9,加入温培养基,大约每100mg初始组织加1ml,轻轻吹打混合物**组织完全分散开。
                10,若部分组织未分散,细胞悬液可以用无菌的平纹纱布或不锈钢(100-200微米)或falcon 70mm细胞滤器进行过滤细胞。如果有较多的组织时,可在每克组织多加入20ml培养基促进沉淀和随后的悬液收集,通常2-3min就足以去除大多数的大块组织。
                 11,用血球计数板测量并定量细胞密度
                 12,将细胞悬液用培养基稀释,使每毫升培养基含有1 x 106个细胞,接种培养瓶中同上要求。
                 13,隔2-4天更换一次培养基(以ph下降为标准)。由于部分细胞粘附较慢甚**易于悬浮生长,所以更换上清液前要先检测上清液中的存活细胞。
            总结:与温消化相比,冷消化可以获得较高的细胞存活率,24h生存率。可保留更多的细胞种类。但是不适合大块组织(大于10g),可以用于小鼠胚胎的上皮细胞,胚鼠的肝脏血细胞培养。
            2.3 细胞传代时,细胞与培养皿的分离
             (1)传代时应检测细胞活力,活力好的细胞应该密度小,活力差的细胞应该密度高些。
              (2)吸出过多的细胞培养基,用不含有钙离子和镁离子的平衡盐溶液或EDTA溶液冲洗细胞。从培养瓶中与细胞生长面相对的一侧加入冲洗液,摇晃培养瓶1-2分钟,冲洗细胞层倒掉冲洗液
            (3)按照2-3ml/25cm2的用量,从培养瓶中与细胞生长面相对的一侧加入所选的解离液,确保解离液可覆盖细胞层,将培养瓶置入37℃条件下培养,轻轻摇晃培养瓶,通常细胞会在5-15分钟内解离。不同细胞系解离所需的时间可能有所差异。对于难以从基质上分离的细胞系,可通过拍打培养瓶的方式加速细胞分离。
            (4)细胞完全分离后,将培养瓶呈直立位放置,使细胞流**培养瓶底部,向培养瓶中加入完全培养基,反复吹打单层细胞表面,使细胞分散。计数细胞并传代。
            要求:对于大多数细胞系或强贴壁性细胞系,用不含钙离子和镁离子的PBS进行冲洗,解离液用0.25%的胰蛋白酶或胰酶+EDTA,以不含有钙镁离子的平衡盐溶液进行配制.
            2.4原代组织中的细胞解离
            (1)shou先无菌采集组织,切除不需要的组织,用无菌手术刀或者剪刀将余下的组织切成2-4mm大小的碎块。用不含有钙镁离子的平衡盐溶液重新悬浮组织碎块,进行清洗。待组织块沉淀后,吸出上清液。反复冲洗2**3次。
            (2)将装有组织块的容器置于冰上,吸出所有的上清液,加入含有0.25%胰酶,不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液(100mg组织加入大约1ml胰蛋白酶溶液。
            (3)在4℃下孵育**6-18小时,以便通过**小的胰蛋白酶活性获得**大的穿透效果。
            (4)小心倒掉过量的胰蛋白酶溶液,将组织块与残留的胰蛋白酶溶液在37℃条件下共同孵育20-30分钟。
            (5)向组织块中加入加热的完全培养基,轻轻吹打,使组织分散。如果使用无血清培养基,则还需要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
            (6)用灭菌的纱布或者无菌不锈钢纱网(100-200μm)过滤细胞悬液,使残余的组织完全分散,计数并接种细胞。
            3细胞传代培养
            传代
            当细胞密度(每平方厘米基质的细胞数)达到铺满整个瓶底的有效基质时,或者当细胞浓度(每毫升培养基的细胞数)超出培养基的能力时,细胞生长停止或生长速度大大放缓。这时就需要更频繁地更换培养基或者进行分瓶培养。
            传代标准:用于判定单层细胞是否需要传代
               (1)细胞密度:正常细胞长**彼此汇合时需要传代。转化细胞同样如此
               (2)培养基耗尽:一般ph降低伴随着细胞密度的增加,这是需要传代的主要指标。
               (3)距上次传代的时间:常规穿戴**好依照严格的时间进行。若到了该传代的时间细胞还没有达到足够高的密度(即细胞没有彼此汇合),则应增加接种密度;相反,如果细胞很快彼此汇合,则要降低接种密度。从而使在一定的接种密度下细胞的周期性生长将与培养时间和细胞产量相一致。理性的细胞浓度是使细胞每3-4天更换培养基,每7天传代。
            传代所需无菌材料:
                 完全生长培养基;以PBS配制的终浓度为0.25%胰酶;培养瓶。
            非灭菌材料:
                 血细胞计数板或电子细胞计数仪
            传代前准备:
            1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
            2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。将试剂及材料置于超净台上,.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。#p#分页标题#e#
            3.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
            4.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。
            5.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
            6.需要传代按以下操作
            从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,仔细检查培养物有无污染或衰退迹象,根据传代标准对该培养物进行观察并决定是否需要传代,
            7.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒,弃去旧培养基,为了避免冲散细胞,沿培养瓶细胞对侧加入PBS(0.2ml/cm2),清洗细胞,去除清洗液,以去除残留血清。
             加胰酶(0.1ml/cm2)到培养瓶细胞面对侧,翻转培养瓶平放以确保胰酶完全覆盖细胞层,静置15-30s,弃去大部分胰酶,只保留少量胰酶,主要不要使单层细胞脱落。使用4℃的胰酶可以防止细胞的成片脱落。
               8,平直培养瓶孵育,直**细胞变圆隆起,竖直培养瓶,单层细胞就会从培养瓶表面滑落(通常发生在5-15min之后),注意不要消化过长时间,另一方面也不要在细胞消化好前强制将细胞吹打下来,这样将导致细胞的成片脱落。
               9,加入培养液(0.1-0.2ml/cm2),用吸管反复吹打单层培养细胞面以分散细胞,**后将吸管的**放于培养瓶底角,上下吹打细胞几次,注意不要产生气泡。充分上下吹打以分散细胞使之处于单细胞悬浮状态。吹打的强度对于各个细胞系有所不同,有的细胞系很容易吹散,而有的则需要大力吹打才能分散。但若吹打力量过大,几       乎所有的细胞都会受到剪切力的机械损伤。原代或早期几代培养的细胞由于他们较脆弱和体积较大而尤其容易受到损伤,对于连续细胞系具有较大弹性,需要大力吹打才能完全解离。
             10,制备单细胞悬液有助于计算细胞增值率或贴瓶率或进行细胞克隆分离。
            11,用血细胞计数板进行细胞计数
            12,稀释悬液到合适的接种浓度。方法一:加入适量细胞悬液到含有已知体积培养基的培养瓶中,此方法适合常规传代,传代瓶数不多且不需要准确的细胞计数和细胞增殖能力的检测。方法二,稀释细胞**所需的总体积,然后分装到各个培养瓶中。此方法适用于同时做多个相同的培养,因为操作的次数减少,而且每一培养瓶中细胞密度完全一致。
            13,用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。盖上培养瓶盖,将培养瓶放回孵育箱中,大约1小时后检查ph的变化,如果培养基在空气相中ph升高,则要将培养瓶移**无菌区域内,向其中快速(1-2s)吹入5%CO2,如果在5%CO2培养条件下ph还是很高,则可以增加CO2浓度到7%尝试。但是此方法不可常用,如果问题长存在可以在配置培养基时降低其ph,同时在培养箱中检查培养基的ph.
            注意事项:
                   1,在任何情况下,主要的细胞分离剂,不论是胰酶还是EDTA,仅做短暂停留,弃去大部分消化液后,仅留少量消化液进行孵育。如果在分离细胞及以后的制备单细胞悬液过程中遇到困难,可采用替代步骤如下。
                    (1)对于有丝分裂期细胞及其他粘附较松的细胞,可以通过轻微机械振荡,摇晃,或大力吹打,进行细胞解离
                    (2)对于不可用蛋白酶的细胞系如受体或细胞表面蛋白分析,以及可造成一些细胞伤害,很难形成单细胞悬液的条件下,利用细胞刮刀进行刮擦。
                    (3)多数的连续细胞系,在用0.01-0.5%粗胰酶,并经完全去除培养基预处理条件下,可以只用胰酶即可将细胞分离。
                    (4)某些粘附性强的连续细胞系和很多早期细胞,用0.25%粗胰酶,及PBSA作为培养基预处理后,可以通过清洗+胰酶方法将细胞解离。
                    2,当把塑料培养瓶放入到培养箱中会因为培养瓶内空气的膨胀使得较大的培养瓶膨胀而不能放平。可以将培养瓶放入培养箱中30min后快速拧松瓶盖以减轻压力,或者可以在盖紧培养瓶前通过挤压培养瓶的顶部或底部来解决这问题。
            传代时的细胞浓度
                 **好的确定方法是以不同的接种浓度接种后作生长曲线,依此选择出延迟期短,能很快进入对数生长期(倍增时间短),并且下次传代时可以方便地到达 对数生长期**高点的**小接种浓度。对于新的培养物,可以先以高浓度接种,再逐渐降低接种浓度直**获得合适的生长周期
            而培养物又无衰退表现。
            1.吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。
              2.向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养  
                 瓶底为宜。
              3.置37℃孵箱或室温(25℃温度)下进行消化,2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察,当发现胞质回缩、细胞间隙增大后,应立即中止消化。
              4.吸出消化液,向瓶内加入Hanks液少量,轻轻转动培养瓶,把残留消化液冲掉,然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化,在吸除胰蛋白液后,可直接加入少量含血清的培养液,终止消化。#p#分页标题#e#
              5.使用弯头吸管,吸取瓶内培养液,按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔,以防用力过猛损伤细胞。
              6.用计数板计数后,分别接种于新的培养瓶中,置CO2培养箱中进行培养。
              7.细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2~3天后应换一次生长液。待细胞铺满瓶皿底面,即可使用。也可继续传代扩大培养或换成维持液。
            注意事项:
              1. 掌握好细胞消化的时间,消化时间过短时,细胞不宜从瓶壁脱落,过长的消化会导致细胞脱落、损伤。
              2. 掌握好消化浓度,当消化液浓度过高时,消化时间应缩短,过低时细胞消化时间相对延长。
            4细胞的冻存及复苏
              细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术。细胞再次长到覆盖率80-90%左右,将其消化后,常规冻存(冻存液要现配)。细胞冻存在-196℃液氮中,储存时间几乎是无限的,若细胞冻存在-152℃,保存期为一年,一年内需复苏重新冻存,冻存复苏的原则是慢冻快融。
            1.冻存细胞 
            (1)选对数增生期细胞(证明无支原体污染),在冻存前1d换液。
            (2)按常规方法把培养细胞制备成悬液,计数,使细胞密度达5×106/m1左右密度,离心,去上清。
            (3)加入配制好的冻存液(培养液6.8ml,小牛血清2ml,DMSO 1ml,5.6%NaHCO3 0.1ml),按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞时培养液中加入保护剂10%二甲基亚砜(DMSO) 或甘油,可使冰点降低,使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
            (4)分装于无菌冻存管中,每管加1.5m1悬液。
            (5)旋好冻存管并仔细检查,一定要盖紧,作好标记。
            (6)冻存:在特殊的仪器或简易的液氮容器中,按-1℃/min的速度,在30~40 min时间内,下降到液氮表面,再停30 min后,直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度,过快能影响细胞内水分透出,太慢则促进冰晶形成。或将细胞冻存于-152℃冰箱。
              操作时应戴防护眼镜和手套,以免冻伤。
            2. 复苏细胞
            细胞复苏的原则-快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化**37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。
            (1) 实验前准备:
            1.将水浴锅预热**37℃
            2.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
            3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。(2).取出冻存管:
            1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号的冻存管。
            2.从液氮罐中取出细胞盒,取出所需的细胞,同时核对管外的编号。(3).迅速解冻:
            1.迅速将冻存管投入到已经预热的36-37℃水浴锅中迅速解冻,并要不断的摇动,使管中的液体迅速融化,30~60s内完成。
            2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解,取出用70%酒精棉球擦拭冻存管的外壁,再拿入超净台内,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10 m1培养液。
            (4)平衡离心:
            用架盘天平平衡后,放入离心机中3000r/min 离心3min或者低速离心(500~1000r/min) 5 min,去上清后再用培养液洗一次。
            (5)制备细胞悬液:
            1.吸弃上清液。
            2.向离心管内加入10ml培养液,吹打制成细胞悬液。
            (6)细胞计数:
            细胞浓度以5×105/ml为宜。
            (7)培养细胞
            将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内,将培养瓶放入37℃和5%CO2的培养箱内2-4小时(或者24-48小时)后换液继续培养培养,换液的时间由细胞情况而定。
            初学者易犯错误:
            1水浴锅未预热或者未预热到37℃。
            2.水浴锅内冻存管太多,导致传热不佳,使融化时间延长。
            3.离心前忘记平衡,导致离心机损坏和细胞丢失。
            4.一次复苏细胞过多,忘记更换吸头和吸管,导致细胞交叉污染。
            5,冻存细胞数量要充分,密度应达到107/m1,在融后稀释20倍后,仍能保持5×105个/m1数量。
                          5 , 细胞计数
            实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作:
            (1)准备工作:
            取一瓶传代的细胞,按照《传代细胞培养(消化法)》中的传代方法繁殖细胞,待长成单层后以被使用。
            (2)细胞悬液制备:
            细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。
            (3)细胞计数:
            1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
            2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
            3.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
            4.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)中没有被染液染上色的细胞数目。#p#分页标题#e#
            5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度:
            (细胞悬液的细胞数)/ml= ( 四个大格子细胞数/4) ×2×104
            说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
            公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:1稀释。
            公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
            1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3
            (4)细胞计数要点:
            1.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;
            2.要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
            3.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确;
            4. 数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
            5. *作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
            (5)初学者易犯的错误:
            1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
            2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
            3. 滴入悬液时的量太多,**使细胞悬液流入旁边的槽中。
            本实验特殊试剂的配制:
            4%台盼蓝母液:称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水**100毫升,用滤纸过滤,4℃保存。
            使用液:使用时,用PBS稀释母液**0.4%即可。
                  6用滤膜滤器过滤液体除菌
            1、将滤膜放入去离子双蒸水中浸泡。用镊子取出滤膜,装入小滤器中,扭紧后再松开一圈(不锈钢滤器螺丝不要拧太紧)。高压蒸气灭菌,其后自然干燥。
            2、使用前先拧紧小滤器,10ml注射器接上小滤器上口,加入2ml待滤液体,推上针芯,并保留数毫升气体。推压针芯,液体滤尽后,继续适当用力推压,针芯有弹性并不能将气体推尽,则表明此滤器滤膜是安装完好的。
            3、正式过滤待滤液体。滤完后再次推空气,如有阻力,表明过滤过程中滤膜保持完好。打开小滤器,再次检查滤膜是否完好。如果发现滤膜破损,应重新过滤。
            注:
            1.小滤膜器使用方便,适于少量液体过滤(也可选用一次性滤器);
            2.有些有机物质(如DMSO)可溶解滤膜,因而不能使用;
            3.市场上有成品出售,可直接应用,但仍应在过滤前后用推注气体的方法检测滤膜是否完好;一些大分子蛋白质可以粘在滤膜上,损失很大,可以先用少量血清或蛋白质冲洗一下滤膜,可减少这种损失。
                                   7,ph 对溶液的关系
            酚红,在ph7.4时,呈红色;ph 7.0,呈橘红丝;ph 6.5呈黄色;低于6.5为柠檬黄;ph7.6,呈桃红色;ph7.8紫红色。由于颜色的判断具有较高的主观性,因此制作一个标准色阶很必要
                                     ph标准色阶的制备
            材料:Hank's平衡盐溶液(HBSS),10倍浓缩液或粉剂,不含碳酸盐或葡萄糖,含有20mmol/l HEPES
            9个瓶子(大小与**长使用的培养基或培养瓶相似),超纯水,
            灭菌的0.1mol/l 氢氧化钠(用超纯水配制,过滤除菌)
            操作步骤:
                 1,配制ph6.5的BSS,分装**7个大小适宜的瓶子中。
                 2,使之与空气达到平衡
                 3,用无菌的0.1mol/l氢氧化钠调节ph**6.8,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8以ph计测定。
                 4,将调节好的BSS过滤除菌,然后存放于培养瓶中
                 5,保持无菌和密封。
                                    10,培养基的更换
             
            需要更换的四个指标:
            (1)PH,当ph从7.0降到6.5时大多数细胞就停止生长;当ph在6.5和6.0之间时细胞开始失去活性。如果培养基从红色变成橙色,再变成黄色,那么就需要更换培养基了。可以通过颜色变化估计ph变化率,如果ph为7.0的培养物每天降低0.1ph单位,那么在换液前多放置一两天没什么关系,但若培养物每天降低0.4ph单位,那么需要在24-48h内换液。
            (2)细胞密度
            (3)细胞类型:正常细胞如二倍体成纤维细胞在高密度时停止分裂,此时细胞停滞在细胞周期的G1期,根据情况换液。
            (4)形态衰退,通过长期定期观察形成经验来判断。
            培养细胞时,培养基的体积与表面积比通常为0.2-0.5ml/cm2,其**适比例是由该细胞的需氧量决定,需氧量高的细胞在较浅的培养基中生长较好(如2mm),需氧量较低的细胞在较深的培养基中生长较好(如5mm)
            更换培养基的无菌材料:
                 移液管,培养基
            操作步骤:
                  (1)准备好超净工作台,以70%乙醇浸泡的纱布擦拭超净工作台及实验所需的试剂及材料,并将擦拭过的试剂及材料立即放到超净工作台。
                  (2)仔细观察培养物是否有污染或衰退迹象。
                  (3)考察上述判别是否需要更换培养基的标准,即ph和细胞密度或浓度,如果需要则按下不操作。#p#分页标题#e#
                   (4)将培养物放于无菌工作区域
                  (5)吸除旧培养基
                  (6)加入同体积的新鲜培养基。**好将培养基预热**37摄氏度。
                  (7)将培养物重新放回培养箱
            注意:当培养物密度过低或生长缓慢时**好进行半量换液,即在第5步仅仅吸出一半旧培养基,在第6步补入相同体积的新鲜培养基。
                  即使是高密度的细胞群体,更换培养基也会刺激细胞进行有丝分裂,因此当不需要有丝分裂时可使用维持培养基。维持培养基是血清浓度降**0.5%-2%或完全不加血清的常规培养基。
                              12,GIEMSA染色
            GIMSA是一种多色的血涂片染料,进行血图片染色时,常与May-Grunwald染液结合使用,但不用于细胞的染色。染色后核呈粉红或紫罗兰色,核仁呈蓝黑色,细胞质呈浅灰蓝色。所染细胞必须乙醇或甲醇固定,制备过程中必须彻底脱水,否则不能正常染色。
            非灭菌材料:
            PBSA; PBSA:甲醇(1:1);未稀释的GIEMSA染液;甲醇;去离子水
            操作步骤:
            1,吸去培养基
            2,用PBSA冲洗单层细胞,去掉冲洗液
            3,加入PBSA/甲醇液0.2ml/cm2,静置2min,然后去掉PBSA/甲醇液
            4,加新甲醇5ml,静置10min.
            5,  弃掉甲醇液,用无水甲醇,冲洗单层细胞,去掉甲醇。
            6,此时,培养瓶经干燥可储存,也可直接进行染色。即使是干的培养瓶,用新配的无水甲醇冲洗后直接染色时非常重要的。如果甲醇倒出,培养瓶静置了一段时间后,残留的甲醇会吸收水分,从而妨碍下一步的染色。
            7,加入纯度GIEMSA染液,0,。08ml/cm2,确保覆盖整层细胞。
            8,2min后,用8ml水稀释染液,并轻轻晃动2min.
            9,用水置换染液,游走浮渣,用自来水冲洗细胞,直到去除片状粉色本底(沉积),
            10,将水倒掉,用去离子水冲洗,在单层细胞仍处于湿润状态时,用显微镜观察细胞,干燥,保存染色,观察时应重新使它湿润。
             
                              13,结晶紫染色
            非灭菌材料:
                  PBSA;PBSA/甲醇(1:1); 甲醇;结晶紫;过滤漏斗和滤纸,大小适合于每个培养皿中盛载5ml的染液;回收染液的瓶子。
            操作步骤:
                  1,吸去培养基
                  2,用PBSA冲洗单层细胞,弃掉冲洗液
                  3,每25cm2加入PBSA/甲醇 5ml,静置2min,弃掉PBSA/甲醇
                  4,加入新甲醇5ml, 静置10min
                  5,弃掉甲醇,将培养皿中的液体倒干净,使其干燥
                  6,每25cm2加入5ml结晶紫,静置10min.
                  7,过滤漏斗放置在瓶上
                  8,将染液倒入漏斗
                  9,用自来水冲洗培养皿,然后用去离子水冲洗,干燥培养皿。
             
                                
                                 14,涂片制备
            无菌材料:用50%-100%血清悬浮的浓缩细胞悬液;血清
            非无菌材料:显微镜载玻片;甲醇;电扇
            操作步骤:
                  1,在载玻片一端滴一滴血清,用第二张载玻片末端蘸取这滴血清,并在**张载玻片上移动,在玻片表面形成一薄层血清。
                  2,用电扇使血清干燥
                  3,用50%-100%血清悬浮细胞,细胞浓度为106/ml,取一滴血清滴在载玻片一端,用第二张载玻片末端蘸取这滴细胞悬液,在**张载玻片上移动,形成一薄层细胞的分布
                  4,迅速干燥载玻片,甲醇固定。
             
                                     15,染色体制备
            固定阻滞在M期的细胞,在低渗培养基中会发生膨胀,将细胞滴在载玻片上,染色,观察
            无菌材料:
                 对数期的培养细胞;用PBSA配制的10-5mol/l 秋水仙胺;PBSA;0.25%的粗提胰蛋白酶
            非灭菌材料:
                 低渗溶液:0.04mol/l KCL; 0.025mol/l 枸橼酸钠;醋酸甲醇固定液;一份冰醋酸加三份无水甲醇或乙醇,新鲜配制并在冰上保存;Giemsa染液;DPx或permount 封固剂;冰;离心管;巴斯德吸管;载玻片;盖玻片#00;载玻片盒;低速离心机;涡流混悬器。
            操作步骤:
            1,将细胞浓度为2 x 104 ** 5 x 104/ml的培养液20ml放入75cm2的培养瓶(每平方厘米4 x 103**1 x104个细胞)中培养。
            2,约3-5天后,细胞处于对数生长期,以1:100(v:v)加入1 x10-5mol/l秋水仙胺(终浓度1 x 10-7)于培养瓶内已有的培养基中。
            3,4-6h后,轻轻去掉培养基,加5ml 0.25% 胰蛋白酶,孵育10min.#p#分页标题#e#
            4,胰蛋白酶西邻悬浮细胞,弃掉上清液中胰蛋白酶。
            5,以5ml低渗溶液重新混悬细胞,37℃,静置20min.
            6,加入等量新鲜配制的冰冷的醋酸甲醇,不停地混合,然后以100g速度离心2min
            7,弃掉上清混合物,在涡流混悬器上振荡细胞团块,再慢慢边混匀边加新制备的醋酸甲醇。
            8,细胞在冰上静置10min.以100g速度离心细胞2min.
            9,弃掉上清中的醋酸甲醇,在0.2ml的醋酸甲醇溶液中重新振荡以混悬细胞团(例如,将试管底部置于振荡器上),直到细胞均匀分散。
            10,用吸管吸一滴细胞悬液到吸管尖部,从30cm处滴到凉的玻片上,倾斜玻片,让流滴流下并铺开。
            11,将玻片在烧杯的沸水上迅速干燥,然后用相差显微镜观察。如果细胞均匀铺展而没有相互接触,则以同样浓度的细胞制备更多片子。如果细胞成堆重叠出现,则稀释悬液2-4倍之后,再准备一张滴液玻片。
            12,进行Giemsa细胞染色:
                    将玻片浸入纯净的染液中2min; 将染色缸放在水池中,加入大约10倍体积的水,让过多的染液从玻片染色缸的顶端溢出;玻片静置2min;用自来水置换出其余染液,然后用自来水逐张冲洗玻片去除染液沉淀(使玻片上呈现粉红色,不透明的外观);显微镜下观察染色情况,对于满意的则将载玻片彻底干燥,用#00盖玻片及DPX或Permount封片。
             
                                16,清洁培养箱
            非灭菌材料
                 水中含有2%新吉尔灭或类似的真菌抑制剂,将上述水溶液注入水盘中;替代的CO2温箱或塑料盒和封口的胶带;去污剂(10%新吉尔灭或另一种灭菌去污剂,70%乙醇)
            操作步骤:
                 1,将全部培养物移**另一个二氧化碳温箱;或包装培养物,并通CO2,然后将其放置在普通培养基或温室中。
                 2,将准备清洁的温箱断开电源
                 3,将温箱中所有的隔板及水盘和可拆卸的部件取出
                 4,用含有去污剂的溶液清洗温箱内部,尽可能擦抹每个角落及缝隙处
                 5,用清水冲洗
                 6,用70%乙醇擦洗温箱内部
                 7,在保持门打开的状态下,加热(不是加CO2)直**温箱干燥。
                 8,用去污剂擦洗隔板及各部件,然后用清水冲洗,用70%乙醇擦洗
                 9,将隔板及各种部件放回温箱中
                 10,放回水盘,注入含有2%新吉尔灭的水
                 11,关门和接通CO2气体
            12,当温度和CO2已趋于稳定,将培养物放回温箱。
             
                         17细胞培养的疑难解析
            1, 培养基的ph值变化迅速:
            (1) CO2分压设置错误:应根据培养基中碳酸氢钠的浓度降低或升高培养箱中CO2分压,当碳酸氢钠的浓度在2.0-3.7g/l,应相应的使用5%**10%的二氧化碳分压。
            (2) 组织培养瓶盖的过紧:应将盖子悬松1/4圈。
            (3) 碳酸氢盐的缓冲能力不足:应加入HEPES缓冲液,使其**
            终浓度为10-25mM
            (4) 细菌、酵母或真菌污染
            2, 细胞无法在培养器皿上贴壁
            (1) 胰蛋白酶消化过度:应缩短胰蛋白酶的消化时间,或者减少用量
            (2) 支原体污染:隔离培养物,检测其是否感染支原体,清除通风橱和培养箱。
            (3) 培养基中无附着因子。
            3, 悬浮细胞聚集在一起:
            (1) 存在钙离子和镁离子:用不含钙离子和镁离子的平衡盐溶液冲洗细胞。轻轻吹打细胞,使其形成单细胞悬液。
            (2) 支原体污染:隔离培养物,检测其是否感染支原体。清除通风橱和培养箱。如果培养物被污染,则丢弃。
            (3) 蛋白酶消化过度,细胞裂解释放DNA.
            4, 原代细胞培养被污染;
            (1) 残留的原代组织将培养物污染:培养前,用含有较高浓度抗生素和抗真菌剂的平衡盐溶液清洗组织碎片数次。
            5, 培养物生长缓慢:
            (1) 培养基或血清改变:比较不同培养基配方中葡萄糖和氨基酸及其他成分有无差异;通过生长实验比较新老批次血清有无差异;增大细胞初始接种密度。
            (2) 必需生长促进成分(如:L-谷氨酰胺或生长因子)耗竭,缺乏或分解:去除原培养基加入新培养基。
            (3) 轻度细菌或真菌污染:在不加抗生素的条件下进行培养,如果污染物被污染,则丢弃。
            (4) 试剂储存不当:血清应在-5℃**-20℃下储存。完全培养基应在2℃到8℃下避光储存,**长可使用两周。尽量减少血清和培养基见光时间。
            (5) 细胞初始接种密度过低。或有限培养物衰老。
            (6) 支原体污染。
            6, 培养物死亡
            (1) 培养箱中无二氧化碳:检测培养箱中二氧化碳使用速度,以便确定何时更换气瓶。经常检查管路连接处是否漏气,不要频繁开启培养箱门。
            (2) 培养箱中温度有波动。
            (3) 抗生素浓度过大,培养基的渗透压不合适。
            7, 细胞污染应对:#p#分页标题#e#
                  § 培养细胞一经污染,多数较难处理。如果污染细胞价值不大,宜弃之;在寻找原因后彻底消毒操作室,复苏或重新购置细胞,再培养。
            §若污染细胞价值较大,又难于重新得到,可采取以下办法清除。
            一、细菌和真菌的清除
            §1、使用抗生素
            §抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。
            §预防用药一般用双抗生素,污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法,于加药后作用24~48小时,再换常规培养液。此法在污染早期有效。
            (二)、支原体的清除
            §1、用MRA处理
            §用MRA(Mycoplasma Removal Agent)处理细胞,每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康.效果好.
             §2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法
            §细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 ,其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低**极限. §如结合敏感抗生素的抑杀作用,可达到更好的效果。
             §3、药物辅助加温处理
            §先用药物处理后,再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时,可杀死支原体,但对细胞有不良影响。
            4、使用支原体特异性血清
            §用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染,因特异抗体可抑制支原体生长,故经抗血清处理后11天即转为阴性,并且5个月后仍为阴性。 但此法比较麻烦,不如用抗生素方便、经济。 
            (四)、污染的预防
            §预防是防止细胞培养过程中发生污染的**好办法。只有预防工作做在前,才能将发生污染的可能性降到**小程度。
            §一般预防可从以下几方面着手:
            1、添加抗生素
            2、从物品、用品消毒灭菌着手
            §细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底,各种溶液灭菌除菌要仔细,并在无菌试验阴性后才能使用。 操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
            3、从操作者做起
            §(1)进无菌室前要用肥皂洗手,按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。
            §(2)操作者动作要轻,必须在火焰周围无菌区内打开瓶口,并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话,若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
            §(3)操作时要常更换吸管,一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。
            4、防止细胞交叉污染
            §在进行多种细胞培养操作时,所用器具要严格区分。
            §在进行换液或传代操作时,注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口,以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
            §细胞一旦购置或从别处引入,均应及早留种冻存,一旦发生污染可重新复苏培养。
            5、无菌室的彻底消毒
            §1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室;
             
            §2)甲醛熏蒸法:甲醛是一种广谱灭菌剂菌,其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
             Invitrogen细胞培养污染策略:
            1, 如果无法替换的培养物受到污染,研究人员可以尝试消除或控制污染。shou先应确定污染物是细菌,真菌,支原体或是酵母。将受污染的培养物与其他细胞系隔离,使用实验室消毒剂清洗培养箱和层流通风处。并检查HEPA滤器。
            2, 高浓度的抗生素和抗真菌剂会对一些细胞系产生毒性,因此应进行剂量效应试验,确定抗生素或抗真菌剂产生你毒性的剂量水平。以下为建议操作程序:
            (1),解离和计数细胞,用无抗生素培养基稀释细胞。浆细胞稀释到常规细胞传代用的浓度。将细胞悬液移入多孔培养板或者数只小培养瓶中。将所选的抗生素以一系列的浓度分别加入各个孔或培养瓶中。
             (2)每天观察细胞是否出现中毒征象如脱落,出现空泡,融合度降低和细胞变圆。
             (3)确定抗生素的毒性水平后,以此浓度的三分之一或二分之一为抗生素使用浓度,进行2到3代的细胞培养。
            (4)将细胞在无抗生素的培养基中培养一代,重复第三步,
                  (5)将细胞在无抗生素培养基中培养4**6代,以确定污染是否已经消除。
            3,抗生素建议使用的浓度如下:
                 Fungizone(两性霉素B)     0.25-2.5μg/ml,  针对于真菌及酵母37℃培养基中可以维持3天稳定性。
                 硫酸庆大霉素               5-50μg/ml    G+,G- 支原体          稳定5天
                 硫酸卡那霉素               100μg/ml     G+, G-,支原体          5天稳定
                 青霉素                      50-100单位/ml   G+                3天稳定#p#分页标题#e#
                 硫酸链霉素                 50-100μg/ml     G+,G-              3天稳定
                 
             
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